使用奧林巴斯 CX33 顯微鏡通過明場和熒光觀察葉片氣孔，具體步驟如下：

奧林巴斯 CX33 顯微鏡樣品準(zhǔn)備

葉片采集：選取健康、具有代表性的植物葉片。盡量在植物生長旺盛期采集，以保證氣孔處于正常生理狀態(tài)。

葉片處理：將采集的葉片用清水沖洗干凈，去除表面的灰塵和雜質(zhì)。對于一些較厚或有蠟質(zhì)層的葉片，可以用刀片輕輕刮去表面的蠟質(zhì)，以便后續(xù)染色劑和熒光染料更好地滲透。

染色與熒光標(biāo)記

明場觀察染色：對于明場觀察，可使用亞甲基藍(lán)等染料對葉片進(jìn)行染色。將葉片浸泡在 0.1% - 0.5% 的亞甲基藍(lán)溶液中 5 - 10 分鐘，然后用清水沖洗，去除多余的染料。亞甲基藍(lán)可以使氣孔周圍的細(xì)胞結(jié)構(gòu)著色，便于在明場下觀察氣孔的形態(tài)和分布。

熒光觀察標(biāo)記：選擇合適的熒光染料標(biāo)記葉片氣孔。例如，用碘化丙啶（PI）對葉片進(jìn)行染色，它可以標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)，使氣孔在熒光下更易觀察。將葉片浸泡在含有適量 PI（如 5 - 10 μg/mL）的溶液中 15 - 20 分鐘，然后用緩沖液沖洗干凈。PI 在藍(lán)光激發(fā)下會發(fā)出紅色熒光，能清晰地顯示出細(xì)胞輪廓，從而突出氣孔結(jié)構(gòu)。

奧林巴斯 CX33 顯微鏡顯微鏡設(shè)置

明場設(shè)置

調(diào)整光源：打開奧林巴斯 CX33 顯微鏡的光源，通過調(diào)節(jié)亮度旋鈕將光源強(qiáng)度調(diào)整到合適的水平。一般來說，對于觀察葉片氣孔，中等強(qiáng)度的光源即可，過強(qiáng)的光源可能會導(dǎo)致圖像過亮，影響對比度，而過弱的光源則會使圖像較暗，細(xì)節(jié)難以看清。

選擇物鏡和目鏡：根據(jù)葉片的大小和觀察的詳細(xì)程度要求，選擇合適的物鏡和目鏡組合。通常，10 倍或 20 倍的物鏡可用于整體觀察葉片氣孔的分布情況，40 倍或更高倍數(shù)的物鏡則用于觀察氣孔的細(xì)微結(jié)構(gòu)。目鏡一般選擇 10 倍的即可滿足大多數(shù)觀察需求。

調(diào)節(jié)聚光器：通過上下移動聚光器，使光線聚焦在樣品上，以獲得最佳的照明效果和圖像對比度。聚光器的高度和孔徑光闌的大小會影響光線的匯聚程度和樣品的照明均勻性，需要根據(jù)實(shí)際觀察情況進(jìn)行微調(diào)。

熒光設(shè)置

選擇濾光片組：根據(jù)所使用的熒光染料的激發(fā)和發(fā)射波長，選擇相應(yīng)的熒光濾光片組。如使用 PI 染色，需要選擇能夠激發(fā) PI 熒光（通常為藍(lán)光激發(fā)）且能過濾掉其他波長光線的濾光片組，以確保只有 PI 發(fā)出的紅色熒光能夠被觀察到，避免其他雜散光的干擾。

設(shè)置激發(fā)光強(qiáng)度和曝光時間：熒光觀察時，要根據(jù)熒光信號的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整激發(fā)光強(qiáng)度和曝光時間。開始時，可將激發(fā)光強(qiáng)度設(shè)置為較低水平，曝光時間設(shè)置為較短值，然后根據(jù)觀察到的熒光圖像的亮度和清晰度，逐漸調(diào)整這兩個參數(shù)，以獲得最佳的熒光圖像效果。但要注意避免激發(fā)光強(qiáng)度過高和曝光時間過長，以免引起熒光淬滅和樣品損傷。

觀察與記錄

奧林巴斯 CX33 顯微鏡明場觀察

放置樣品：將處理好的葉片樣品放在顯微鏡載物臺上，用載玻片和蓋玻片固定好，確保葉片平整，避免產(chǎn)生褶皺或氣泡影響觀察。

對焦與觀察：通過粗調(diào)焦旋鈕將物鏡靠近樣品，然后緩慢調(diào)節(jié)微調(diào)焦旋鈕，使葉片圖像清晰對焦。首先在低倍物鏡下找到葉片的邊緣或葉脈等標(biāo)志性結(jié)構(gòu)，然后移動載物臺，找到含有氣孔的區(qū)域。觀察氣孔的形態(tài)、大小、分布密度以及周圍細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征。注意觀察氣孔是開放狀態(tài)還是關(guān)閉狀態(tài)，記錄不同部位氣孔的特點(diǎn)。

LV2000顯微鏡相機(jī)圖像記錄：如果顯微鏡配備了成像系統(tǒng)，可以拍攝明場下葉片氣孔的圖像。拍攝時，要確保圖像清晰、對比度良好，能夠準(zhǔn)確反映氣孔的形態(tài)和分布情況?？梢耘臄z多張不同視野的圖像，以便后續(xù)分析和比較。

熒光觀察

切換到熒光模式：在明場觀察完成后，關(guān)閉明場光源，切換到熒光照明模式。確保熒光濾光片組已正確插入光路中。

重新對焦與觀察：由于熒光圖像的焦點(diǎn)可能與明場略有不同，需要再次微調(diào)焦旋鈕，使熒光圖像清晰對焦。觀察葉片氣孔在熒光下的形態(tài)和分布。注意熒光信號的強(qiáng)度、分布范圍以及與周圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)的關(guān)系。例如，PI 染色后，氣孔周圍的細(xì)胞壁會發(fā)出紅色熒光，形成清晰的輪廓，可更準(zhǔn)確地觀察氣孔的邊界和形狀。

圖像記錄與分析：使用成像系統(tǒng)拍攝熒光圖像，記錄氣孔在熒光下的特征?？梢詫晒鈭D像進(jìn)行進(jìn)一步的分析，如測量氣孔的面積、周長等參數(shù)，或者分析熒光強(qiáng)度的分布情況，以獲取更多關(guān)于氣孔結(jié)構(gòu)和功能的信息。

在觀察過程中，要保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境的穩(wěn)定，避免震動和溫度變化對顯微鏡成像的影響。同時，為了獲得更準(zhǔn)確和全面的結(jié)果，可以對多個不同品種、不同生長條件下的葉片進(jìn)行觀察和比較，分析葉片氣孔在不同情況下的差異和特點(diǎn)。